经胆管192Ir内照射对胆管、肝脏放射损伤的实验研究

潍坊医学院附属医院影像中心介入科（曹贵文  王滨  孙业全  宁厚发  隋守光  王秀春）

【摘  要】 目的 探讨经胆管¹⁹²Ir内照射的安全性、可行性以及有效治疗范围，为肝门部胆管癌经胆管¹⁹²Ir内照射提供理论依据。材料和方法 实验动物为雄性健康杂种犬16只，据照射剂量随机分成4组，每组4只。内照射前从犬肝边缘切取1cm³大小肝组织以便作对照研究。术中将近距离治疗施源器经胆囊送入胆囊管与肝总管汇合处并用金属夹固定，根据预先设定的剂量进行胆管内照射。10d后处死动物，取被照射胆管中央部分长约5mm胆管，及距离胆管壁由近及远按设计的距离分别取1mm³大小肝组织，制备光镜切片，作HE染色；同时用2.5%戊二醛固定后常规制备电镜切片。光镜下观察胆管及周围肝组织的放射损伤并对损伤程度打分。电镜下观察肝组织超微结构损伤变化并计数凋亡肝细胞。结果 经胆管¹⁹²Ir内照射30Gy时，胆管损伤达部分肌层；50Gy时，胆管仅存外膜；60Gy时，胆管出现全层坏死。胆管周围肝组织放射损伤，随剂量增加而加重。在胆管最大安全耐受剂量50Gy时，距胆管0mm~15mm处肝细胞核出现不可逆性改变。结论 正常胆管对¹⁹²Ir内照射有良好的耐受性。在胆管最大安全耐受剂量50Gy时，经胆管¹⁹²Ir内照射有效的治疗范围可达15mm。

【关键词】 ¹⁹²Ir内照射；放射损伤；凋亡；肝脏；胆管

The Experimenal Study of the Radiation Injury on Bile Duct and Liver Tissue

  【ABSTRACT】 Objective  To investigate the safety, acceptance and the effective  extent of  ¹⁹²Ir-internal irraadiation ，in order  to  provide guideline for                 

HC in Theory.  Material and Methods Sixteen hybrid dogs were used in the experiment. The animals were divided into 4 groups, 4 animals in each group. The brachythererapy applicator was introduced into the confluence bureau of cystic duct and common hepatic duct during the operation. The animals in group A~D were irradiated by ¹⁹²Ir-internal irradiation with 30Gy, 40Gy, 50Gy, and 60Gy at referance dose point respectively. Animals were put to death after 10 days subsequence. Material was gotten from radiation cystic duct and difference liver tissue distancing cystic duct. Injury of cystic duct and liver tissue near bile duct of dog was observed by light microscope and transmission electron microscope. Radiation injuries were studied. Results  Within the safest endurance of bile duct, unreversed injury of the liver from 0 mm to 15 mm left bile duct was observed by transmission electron microscope and light microscope at dose 50 Gy. Conclusions  The normal bile duct has good endurance to ¹⁹²Ir-internal irradiation. Within the safest endurance of bile duct 15 mm can be seen as an effective theraeutic extent by ¹⁹²Ir-internal irradiation therapy.

  【Key words】 ¹⁹²Ir-internal irradiation; radiation injury; apoptosis; liver; bile duct

肝门部胆管癌(hilar cholangiocarcinoma, HC)约占胆管癌总数的58%~75%，是各类胆管癌中最常见、预后最差和治疗最困难者。 近年来的发病率有增多趋势^[1]。本研究以犬为实验对象，将犬胆管接受30Gy~60Gy不等剂量的¹⁹²Ir单次内照射，旨在探讨经胆管¹⁹²Ir内照射对胆管周围肝组织的损伤，正常胆管的耐受性，探讨该方法的临床安全性及有效治疗范围，为临床上经胆管¹⁹²Ir内照射治疗HC提供理论依据。

材料和方法

1. 雄性杂种犬16只，体重为25Kg~30Kg，由潍坊医学院动物试验中心提供。所有实验动物按照射剂量随机分成4组，A组30Gy（4只），B组40Gy（4只），C组50Gy（4只），D组60Gy（4只）。

2. 动物实验方法

( 1 ) 麻醉动物、施源管置入、定位

实验动物用0.5%的硫贲妥钠静脉给药，将麻醉好的动物固定于实验台上，手术下将施源管末端送到胆囊管与肝总管汇合处时用金属夹固定。内照射前从犬肝边缘切取1cm×1cm×1 cm大小肝组织以便作对照研究。

( 2 ) ¹⁹²Ir内照射

应用HY-HDR18后装治疗机，放射源采用¹⁹²Ir，源活度为3.12Ci，设置驻留位20mm，步长2mm。A、B、C 、D四组实验动物分别接受总剂量为30Gy、40Gy、50Gy和60Gy单次内照射。内照射结束后撤出施源管，胆囊底切口作荷包缝合。术后肌注青霉素40万U，硫酸庆大霉素8万U。待实验犬清醒后送返动物房饲养。

3. 病理标本处理和观察

( 1 ) 标本处理

内照射10d后处死动物，取被照射胆管中央部分长约5mm胆管，常规制备光镜切片；被照射胆管外距离胆管壁由近及远3mm、5mm、7mm、9mm、11mm、13mm、15mm、17mm处肝组织分别取材和内照射前切取的正常肝组织制备光镜切片和电镜切片。

( 2 ) 标本观察

1). 病理HE染色结果判定：在光镜下观察胆管的损伤，并对损伤程度打分。粘膜层：根据损伤严重程度分为+、++、+++、++++，总计4分；粘膜下层：观察有无出血、固有腺体的破坏程度、炎细胞浸润及破坏程度，也分+、++、+++、++++，总计4分；肌层：观察肌层的破坏程度分+、++、+++、++++，总计4分；外膜：根据外膜的损伤程度分+、++、+++、++++，总计4分。

2). 病理电镜结果判定

在高倍电镜下以染色质边集、核浓缩、核碎裂、核溶解、以及线粒体肿胀、空泡化、髓鞘样变为标准判断为细胞凋亡后，在低倍电镜下记数约100个肝细胞中凋亡细胞的数量，对所得数据进行统计分析。

4. 统计学处理

实验数据用均数±标准差（’x±s）表示。所有资料的统计学分析均由计算机完成，统计软件为CS2000，统计分析方法采用t检验、f检验，检验水准为0.05(双侧)。

结 果

1. 经胆管¹⁹²Ir内照射后胆管的变化

经胆管¹⁹²Ir内照射在剂量为30Gy时，实验中发现胆管部分上皮呈灶状坏死，伴有出血，可见正常固有腺体；经胆管¹⁹²Ir内照射在剂量为40Gy时，实验中发现胆管广泛坏死，无正常固有腺体，肌层成片状坏死；经胆管¹⁹²Ir内照射在剂量为5G0y时，实验中发现胆管肌层广泛坏死，仅存外膜，经胆管¹⁹²Ir内照射在剂量为60Gy时，实验中发现胆管壁出现全层坏死，部分外膜脱落。图1显示了不同剂量下胆管的损伤程度及剂量效应曲线。

2. 经胆管¹⁹²Ir内照射后胆管周围肝组织的变化

( 1 ) 电镜下不同剂量、距照射胆管不同距离凋亡肝细胞计数统计结果，见表1

( 2 )  距照射胆管不同距离肝组织的照射剂量分布曲线图，见图2

 

表1  电镜下不同剂量、距照射胆管不同距离凋亡肝细胞计数统计结果（‘x±s）

剂量	n	正常组织	不同距离
(Gy)			7mm	9mm	11mm	13mm	15mm	17mm
30	4	1.20±0.10	22.13±2.11	19.13±1.25	5.21±1.02	1.21±0.07	1.20±0.09	1.21±0.10
		t	19.82	28.92	7.83	0.17		0.14
		P	＜0.01	＜0.01	＜0.01	＞0.05		＞0.05
40	4	1.31±0.14	0.23±0.03	18.25±1.62	18.81±1.10	5.36±1.10	1.30±0.10	1.31±0.11
		t	15.42	19.93	31.82	7.36	0.12
		P	＜0.01	＜0.01	＜0.01	＜0.01	＞0.05
50	4	1.10±0.23	0	0	20.31±1.13	20.11±1.25	15.21±1.23	1.12±0.18
		t			33.70	30.17	22.76	0.13
		P			＜0.01	＜0.01	＜0.01	＞0.05
60	4	1.12±0.11	0	0	22.19±1.37	20.13±1.15	16.06±1.11	1.12±0.08
		t			30.54	33.35	26.68
		P			＜0.01	＜0.01	＜0.01

图1  不同剂量内照射对胆管的损伤程度

图2  距照射胆管不同距离肝组织的照射剂量分布曲线图

 

讨论

¹⁹²Ir是一种人工放射性核素，半衰期为74天，它是通过¹⁹¹Ir在原子反应堆中经热中子轰击而生成的不稳定放射性同位素。在衰变过程中，释放出平均能量为380keV的γ射线，能够破坏肿瘤细胞核的DNA双链，使肿瘤细胞失去繁殖能力。¹⁹²Ir比较适用于高剂量率组织间插植和腔内放疗，是目前胆管腔内放射治疗常用的放射源^[2]。

自1981年Herskovic经胆管¹⁹²Ir内照射治疗用于治疗HC以来，国内外学者许多学者不断报道了经胆管¹⁹²Ir内照射治疗效果。Milella等^［3］报道12例失去手术机会的HC患者经上述方法治疗后，平均生存期23个月，1、2年生存率分别为61％、43％。Dvorak等^［4］对不能手术的8例HC患者行PTCD并经胆管¹⁹²Ir内照射治疗，中位生存期为275天。经胆管¹⁹²Ir内照射治疗效果已得到众多学者的认可，但是同时也不可避免的存在一定的副作用，临床上如何达到最佳治疗剂量，既最大限度地杀灭肿瘤细胞又避免严重并发症的出现有待进一步研究。本实验以犬为实验对象，将犬胆管接受30Gy~60Gy不等剂量的¹⁹²Ir单次内照射。研究胆管的损伤、肝功能影响和胆管周围肝组织的损伤，以探讨该方法的临床安全性及有效治疗范围，为临床上经胆管¹⁹²Ir内照射治疗肝门部胆管癌提供理论依据。

临床上经胆管¹⁹²Ir内照射治疗多数是在PTCD基础上置入金属内置架进行。本实验在设计时曾考虑：经胆管¹⁹²Ir内照射前，在实验犬胆管内置入金属内置架，使实验更接近于临床。但国内孙坚^[5]等有报道金属内支架对放射线衰减＜1.2%，在胆管内照射时可以不考虑金属内支架对射线的影响。所以，在不影响实验效果的前提下，没有置入金属内支架。

本实验观察到：随着放射剂量的增加，胆管壁的放射损伤从粘膜表面到肌层再到胆管壁外膜层逐渐加重。经胆管¹⁹²Ir内照射在剂量为30Gy时，实验中发现胆管部分上皮呈灶状坏死，伴有出血，并可见正常固有腺体；剂量为40Gy时，发现肌层成片状坏死，无正常固有腺体；在剂量为5G0y时，发现胆管肌层广泛坏死，仅存外膜，剂量为60Gy时，发现胆管壁出现全层坏死，外膜脱落。图1显示了不同剂量下胆管的损伤程度及剂量效应曲线。剂量与效应成正比，呈现明显的剂量效应关系。实验显示正常胆管对经胆管¹⁹²Ir单次内照射有良好的耐受性，为今后胆管肿瘤近距离治疗提供了初步的实验室依据。

本课题设计用凋亡这一指标来研究经胆管¹⁹²Ir内照射的有效治疗范围，在电镜下观察细胞核的超微结构变化判断肝细胞凋亡，并作统计分析。肿瘤细胞对放射线比正常肝组织更为敏感，更容易发生凋亡。所以，我们认为用凋亡这一指标来研究经胆管¹⁹²Ir内照射的有效治疗范围更为敏感。

本课题显示：在放射剂量为30Gy时，胆管周围肝组织距胆管0mm~5mm范围肝细胞光镜下完全坏死，电镜下凋亡肝细胞计数正常组织与7mm、9mm、11mm比较差异均有显著性差异(Р＜0.01），在放射剂量为40Gy时，胆管周围肝组织距胆管0mm~7mm范围肝细胞光镜下完全坏死，电镜下凋亡肝细胞计数正常组织与9mm、11mm、13mm比较差异均有显著性差异(Р＜0.01），在放射剂量为50Gy时，胆管周围肝组织距胆管0mm~9mm范围肝细胞光镜下完全坏死，电镜下凋亡肝细胞计数正常组织与11mm、13mm、15mm比较差异均有显著性差异(Р＜0.01），在放射剂量为60Gy时，胆管周围肝组织距胆管0mm~9mm范围肝细胞光镜下完全坏死，电镜下凋亡肝细胞计数正常组织与11mm、13mm、15mm比较差异均有显著性差异(Р＜0.01），可以认为：在放射剂量为30Gy、40Gy、50Gy、60Gy时，经胆管¹⁹²Ir内照射的有效治疗范围分别是距胆管11mm、13mm、15mm、15mm。实验中我们观察到：在放射剂量为60Gy时，胆管出现全层坏死，尽管没有出现胆汁漏，但存在潜在危险；在放射剂量为50Gy时，肌层大部分坏死，外膜存在。可以看出放射剂量为50Gy时更为安全。尽管在放射剂量为50Gy和60Gy时，相关数据上存在差别，但有效治疗范围都是15mm。所以，15mm可作为经胆管¹⁹²Ir内照射在胆管最大安全耐受剂量时的有效治疗范围。

用HC犬动物模型来研究¹⁹²Ir内照射的治疗范围最为理想，但该动物模型制作相当困难，周期长，成功率极低^[6]。目前，有关HC的动物模型多用小鼠制作，用来研究该病的发病机理及发生发展过程^[7]。未发现应用HC犬动物模型的相关报道。但是，与正常肝组织相比肿瘤细胞对放射线更为敏感，更容易发生凋亡，可以推测我们课题得出的结论更为安全可靠。

参考文献

1.郭仁宣主编. 胆道肿瘤外科学[M.]. 沈阳: 辽宁科学技术出版社, 2002: 258-259.

2.王迎选, 王所亭主编. 现代立体放射治疗学[M.]. 北京: 人民军医出版社, 1999，137-140.

3. Milella M, Salvetti M, Cerrotta A, et al. Interveentional radiology and radiotherapy for inoperable cholangiocarcinoma of the extrahepatic bile ducts [J]. Tumori, 1998, 84(4): 467-471.

4. Dvorak J, Jandik P, Melichar B, et al. Intraliminal high dose rate brachytherapy in the treatment of bile duct and gallbladder carcinomas [J]. Hepatogastroenterology, 2002, 49(46): 916-917,

5. 孙坚, 何贵金, 张申众, 等. Pd放射性支架持续性照射犬胆管放射性损伤的动物实验研究[J]. 中国实验动物学杂志, 2002, 12(5): 276-278.

6.Jiao W, Yakushiji H, Kitajima Y, et al. Establishment and characterization of human hilar bile duct carcinoma cell line and cell strain [J]. J Hepatobiliary Pancreat Sugg, 2000, 7: 417-425.

7.Yamada N, Chung Y S, Arimoto Y, et al. Establishment of a new human hilar bile duct carcinoma cell line and experimental liver metastatic model[J]. Br J Cancer, 1995, 543-548.

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