125I放射性粒子植入对兔VX2肝移植瘤微血管密度及血管内皮生长因子的影响

¹²⁵I放射性粒子植入对兔VX2肝移植瘤微血管密度及血管内皮生长因子的影响

曹贵文¹崔新江¹宁厚法¹杨莉莉² 张云峰²

（¹潍坊医学院附属医院介入肿瘤科，山东潍坊 261031；²潍坊医学院医学影像中心研究生）

摘 要: 目的 探讨¹²⁵I放射性粒子植入对兔VX2肝移植瘤微血管密度(microvascular density, MVD)的影响以及对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达的影响，MVD和VEGF的相关性及其与影像和临床病理的关系，评价¹²⁵I放射性粒子植入对兔VX2肝移植瘤血管生成及其疗效的影响，为原发性肝癌的放射性粒子植入治疗提供实验数据及理论依据。方法 将36只荷瘤兔随机分成6组：对照组6只、粒子组30只。分别于接种后1周、2周、1月、2月、3月取材。测量肿瘤体积并行HE染色进行病理学检查，免疫组化染色检测肿瘤VEGF、CD31的表达。结果 对照组肿瘤体积较前增大，粒子组肿瘤体积明显缩小。两组间相互比较粒子组与对照组之间均有明显的差异性(P<0.01)；粒子组VEGF、MVD明显低于对照组(P<0.05)，植入粒子不同时期VEGF、MVD有明显的差异（P<0.05）。结论¹²⁵I放射性粒子植入可明显使肿瘤MVD计数及VEGF的表达降低，可以有效地破坏植入粒子边缘肿瘤组织的微血管，有效地抑制血管形成并减少肿瘤组织的血液供应，从而达到灭活植入粒子边缘肿瘤组织的目的。

关键词: 癌，肝细胞；¹²⁵I放射性粒子植入；微血管密度，血管内皮生长因子

EFFECT OF ¹²⁵I RADIOACTIVE PARTICLE ON MICROVESSEL DENSITY AND VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR IN RABBIT VX2 HEPATIC IMPLANTATION TUMOR Cao Gui-wen, Cui Xin-jiang, Ning Hou-fa, et al  (Department of Interventional Radiology, Affiliated Hospital, Weifang Medical University, Weifang 261031, China)

ABSTRACT  【0bjective】 To investigate the effect on the expression of microvascular density (MVD) and vascular endothelial growth factor(VEGF) in hepatic implantation tumor after ¹²⁵I radioactive particles implanted, the correlation between MVD and VEGF, the relationship between them and the image and pathology characters in VX2 hepatic implantation tumor. To evaluate the therapeutic effect and angiogenesis of the rabbit VX2 hepatic implantation tumor. 【Method】36 rabbits with VX2 hepatic implantation tumor were collected and randomized into six groups, Group A: six rabbits, control group; group B: thirty rabbits, particle group. When 1w, 2w, 1m, 2m, 3m after operation, the rabbits were sacrificed and the tumors were taken out. detect the size and the growth of the tumor, and then immunohistochemistry were performed to demonstrate the expression of VEGF and CD31 to find the change and effect of  the tumor after  ¹²⁵I radioactive particles implanted. 【Result】The size of the tumor decreased after the treatment in group B. The tumor size in group A enlarged obviously, and there was significant difference between this rate and the rates of the group B (P<0.01). VEGF protein was detected by immunohistochemistry, the expression intensity in the group A is the highest. Compared with the data of the group B, it had obvious differences (P<0.01). The right rate of the group B (13%) was lower than that of group A (15.4%), but there was  significant difference between them (P<0.05). 【Conclusion】Rabbit VX2 hepatic implantation tumor is a tumor with sufficient blood supply. ¹²⁵I radioactive particles implanted can obviously depress the expression of VEGF and lessen angiogenesis of the tumor. And the treatments can inhibit the growth of the tumor implanted on the rabbits.

Key words：Carcinoma, hepatocellular; ¹²⁵I radioactive particles implanted; Microvascular density; Vascular endothelial growth factor

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），是最常见原发于肝脏的恶性肿瘤，在恶性肿瘤发病率中位居第二^[1]。目前，手术肝癌切除仍是肝肿瘤治疗的首选，但肝细胞癌多在肝硬化基础上发生，手术切除率仅8%-25%^[2]。虽然现阶段有多种治疗方法以及多种方法的联合应用，但治疗效果十分有限。¹²⁵I放射性粒子组织间植入是目前治疗原发性肝癌的一种新方法。尽管该疗法在临床已经得到较多专家和同仁们的认可，但该疗法的具体作用机理未阐明，国内亦缺乏相关基础试验资料。因此，本研究通过建立兔VX2移植瘤模型，进行¹²⁵I粒子组织间植入治疗，探讨其组织间植入治疗肝癌的有效性，探索植入不同时期¹²⁵I粒子对肿瘤细胞MVD及VEGF的影响，研究其对肿瘤血管生成的影响，为该疗法在临床的应用、推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

健康纯种新西兰大白兔36只，雌雄不限，3-4月龄，重2.5-3.0kg，平均（2.7±0.3）kg，由山东省农科院提供（许可证号：sxk-鲁-2004-0013）；VX-2荷瘤种兔由协和医科大学基础医学院提供（许可证号：sexk-京-2005-0002）；¹²⁵I放射性粒子（购于上海欣科医药有限公司）；VEGF兔抗兔多克隆抗体（购于武汉博士德）；CD31鼠抗人单克隆抗体（购于丹麦Dako公司）；即用型SABC试剂盒及DAB显色剂（购于武汉博士德）。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立及治疗

1.2.1.1 兔VX2肝癌模型的建立

参照文献报道的方法^[3]采用开腹指示下肿瘤组织块直接种植法分两批建立模型，第一批16只，第二批20只，共36只，每批手术时间2小时之内进行完。

1.2.1.2 实验动物分组及¹²⁵I粒子植入治疗 

随机将符合实验要求的荷瘤兔分为对照组（A组）、¹²⁵I粒子植入组（B组）共6组，每组6只。所有实验兔麻醉固定后，行粒子植入治疗，术者及助手穿铅衣，带铅眼镜，穿好隔离衣及无菌手套。荷瘤兔上腹部肝区备皮，常规消毒铺巾。于剑突下约1cm处作一正中切口3cm左右，逐层分离，直至爆露肝脏，用无菌镊将肝左叶及肿瘤组织轻拖出腹腔外，直视下进针穿刺，待穿刺针尖位于肿瘤组织内时，由助手用止血钳固定穿刺针，术者左手持粒子枪，右手持针芯将粒子植入肿瘤组织内，拔除穿刺针，明胶海绵填塞，确认无活动性出血后将肝脏回纳入腹腔，逐层缝合。A组：对照组，未行特殊治疗； B 组：粒子组，肿瘤组织内均匀植入¹²⁵I粒子，治疗1周（w）-3月（m）。

1.2.2 检测指标 

术前及术后定期行B超检查，以确定肿瘤的体积及生长情况。分别于接种后1w、2w、1m、2m、3m取材，肿瘤组织以10％甲醛固定，经脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察。取石蜡切片分别用SP法及EnVision法进行VEGF、CD31的免疫组织化学染色，以PBS代替一抗作为阴性对照，VEGF于光镜下先在低倍视野选择3个VEGF染色最丰富区（即热点区），然后在高倍视野下每一热点中连续记数100个癌细胞记录其中阳性细胞数，计算阳性细胞百分数取平均值。MVD计数参照Weidner等^[4]的方法。

1.2.3 统计学处理 

连续正态分布变量资料数据以( )表示，正态分布资料采用单因素方差分析；两两比较：方差齐同时用Bonferronl检验，方差不齐时用Tamhane’s T检验；采用 SPSS11.5 统计软件进行分析，P<0.05时差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 兔VX2肝移植瘤形态学观察 

标本取出后可见一中等大小的类圆形肿块，肿瘤色白、质韧，与正常肝组织无明显分界，部分突出于肝脏轮廓之外。剖面呈灰白色鱼肉样组织，质中等。粒子组于植入粒子周围的肿瘤组织可见片状坏死灶，部分可见液化坏死，剖开后有暗红色浓稠坏死物流出，形成壁厚薄不均的残余瘤腔。

2.2 病理学检查 

对照组，未经治疗，肿瘤呈侵袭性生长，并与周围肝实质分界不清。粒子植入后两周，肿瘤生长受到遏制，体积开始缩小。粒子植入治疗后1月，肿瘤体积明显缩小，活性肿瘤组织减少。粒子植入后2-3月，肿瘤组织消失，瘤周可见广泛纤维组织包裹。

2.3 肿瘤的影像学特点 

种植后1周内肿瘤较小时超声显示困难，2周左右肿瘤变大，超声表现肿瘤为圆形或类圆形略高、等、低回声结节，无包膜，边界清楚，有较明显的声晕，内部回声可欠均匀，当肿瘤内部出现坏死时可呈低或无回声，彩色多普勒及能量多普勒显示血流信号较丰富，以周边血供为主，可呈点、粗点状、棒、环条状，可有血管分支进入肿瘤内。

2.4 肿瘤的体积 

利用肿瘤的最大径、最小径计算肿瘤术前、术后的体积，观察其变化情况。粒子植入前各组间肿瘤平均大小无统计学意义。在疗效观察期满3个月的试验兔中，对照组术前术后肿瘤体积变化较大，粒子组肿瘤体积均明显缩小（表1）。

表1 粒子治疗前后B超观察瘤体积变化（cm³）

例数  治疗前    治疗后1周    治疗后2周    治疗后1月   治疗后2月   治疗后3月

对照组  6   2.52±0.25    7.51±2.33    23.51±2.35    36.25±4.56      ——        —— 粒子组  30  2.85±0.21   2.61±0.81#   1.52±0.51#    0.86±0.28#     0.46±0.21    0.17±0.06

      ^#与治疗前比较P<0.05。

2.5抑瘤率 

各治疗组在治疗后对肿瘤的控制情况采用抑瘤率来表示，抑瘤率=（治疗前肿瘤体积－治疗后各时期肿瘤体积）／治疗前肿瘤体积×100%（表2）。统计学分析显示，在治疗后的不同时期抑瘤率的差别均有统计学意义(P<0.05)，并且在治疗1周-1月时抑瘤率的变化最为显著，1月后该差别逐渐减少。

我们通过测量瘤体的双径，即将治疗前后影像学上2个相互垂直的肿瘤最大直径的乘积进行比较，评价标准^[5]为：①完全缓解(CR)：肿瘤完全消失，影像学检查不能显示肿瘤或仅有条索状影像或粒子的金属影；②部分缓解(PR)：肿瘤缩小，乘积比治疗前减少≥50％；③无变化(NC)：乘积比冶疗前减少＜50％或增大＜25％：④进展(PD)：乘积比治疔前增大≥25％或出现新病灶。粒子组在观察期间肿瘤完全缓解者(CR)，以及部分缓解者(PR)，总共25例（25/30），治疗组总体有效率为83.3%（CR+PR）；而对照组在术后观察期内肿瘤体积均有不同程度的增大，并且在1月内全部死亡，自然生存期22.5±6.3d。

表2 治疗组各时期的抑瘤率（%）

例数   治疗后1周       治疗后2周      治疗后1月      治疗后2月     治疗后3月

粒子组  30     7.24±0.63       45.61±11.54     68.34±9.57      81.24±2.67     91.54±1.34

2.6肿瘤VEGF的表达情况

免疫组化染色显示，VEGF蛋白在肿瘤中呈弥漫性表达，在肿瘤边缘以及坏死区周围的瘤巢中表达较强，表达部位主要集中在肿瘤细胞的胞浆、肿瘤周围肝细胞胞浆、胞膜以及部分成纤维细胞中。治疗前VEGF蛋白表达的总阳性率为75.4%，治疗3月后粒子组VEGF蛋白表达阳性率为13.6%，并且阳性表达的例数也明显减少，高倍视野下已经难以找到阳性细胞。随着植入粒子时间的延长，VEGF的表达逐渐下降（表3）。

2.7 肿瘤MVD的分布情况

    CD31阳性染色表现为血管内皮细胞胞浆被染成黄色或棕黄色颗粒，可出现颗粒状、条状、裂隙状、簇状和不规则管腔等不同形态。肿瘤微血管分布不均匀，以肿瘤周边和正常肝组织之间的移行带较为密集，坏死区周围也常有密集分布。¹²⁵I粒子植入治疗可以减少肿瘤新生血管的形成，并随着时间的延长治疗效果越好（表3）。

表3 治疗后肿瘤MVD计数，VEGF阳性细胞率的改变

对照组       术后2周       术后1月       术后2月       术后3月

MVD   23.6±2.5        21.2±4.5         18.7±6.2          15.2±3.7          13.6±6.1# VEGF  75.4±16.2      68.2±13.4        48.7±7.1       25.3±7.5        11.6±3.9*

      与对照组比较，差异具有显著性，^# P<0.05，* P<0.01

3 讨论

¹²⁵I放射性粒子组织间植入近距离治疗是指将微型放射源植入肿瘤内或受肿瘤侵犯组织中，通过放射源持续发出发射低能量γ射线，使肿瘤组织受最大程度毁灭性杀伤，而正常组织不损伤或轻微损伤（也称体内伽玛刀）。近20年由于新型、低能、安全、易防护放射性核素¹²⁵I的研制成功、计算机三维治疗计划系统出现，影像设备B超或CT监视手段的提高，使¹²⁵I粒子植入安全性提高，从而得以迅速发展。由于其创伤小、靶区剂量高、对周围正常组织损伤小等特点，有着广阔的临床应用前景。放射性粒子肿瘤内介入放射治疗已成为目前国内外开展最热门的肿瘤治疗技术之一。

 在本实验中，¹²⁵I粒子植入部位周围的正常器官、组织大体上未见明显放射损伤改变，与文献报道^[6]相似。

从实验结果看，¹²⁵I粒子的植入，对瘤重量、瘤体积都产生了影响。通过对病理切片的分析，发现VX2瘤中央呈大片凝固性坏死，残存肿瘤细胞呈岛状分布，可见大量凋亡细胞，核固缩深染，肿瘤周围广泛纤维化，小血管扩张充血，有许多脂肪细胞空泡及少量淋巴细胞浸润。这种影响产生的可能有：1、射线的直接作用：电离辐射的能量直接沉积于生物大分子的电离和激发，破坏机体的核酸，蛋白质和酶的具有生命功能的物质。2、射线的间接作用：电离辐射首先直接作用于水，使水分子产生一系列原发辐射分解产物（H·、·OH2、e-水合、H2和H2O2等），然后再通过这些辐射分解产物作用于生物大分子，引起后者的物理和化学变化。3、电离辐射引起肿瘤供血血管内皮细胞损伤，从而影响肿瘤血供造成局部坏死。

MVD是通过应用一些特异抗体(如CD31、CD34、FVⅢR-Ag)单抗标记肿瘤组织血管内皮细胞，计数肿瘤组织单位面积内的微血管数目。国内外的研究表明CD31对肿瘤微血管的标记效果更好^[7-8]。肿瘤的生长和转移是一个复杂的多步骤的过程，受诸多因素的影响。研究发现，实体瘤的生长是血管依赖性的，血管作为肿瘤间质的一种重要成分，与肿瘤细胞相互作用，构成完整的微生态系统，因此血管生成对实体瘤的快速生长和转移尤为重要。MVD被认为是血管形成活动效应的标志。MVD不仅与增殖的肿瘤细胞供养和营养供给有关，而且能显示其侵袭性和转移性，这是因为新生血管是肿瘤细胞的第一号目标。因此MVD是反映肿瘤生物行为的重要参数，与肿瘤的转移、复发、预后等关系密切。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)又称血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)，是Ferrara^[9]等于1959年从牛脑垂体滤泡星状细胞培养基中分离纯化出的一种糖基化分泌性多肤因子，其分子量为45,000道尔顿，由分子量各为23,000道尔顿的不同亚单位组成的二聚体，按所含的氨基酸数目不同可分为4种形式:VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206。它们的半衰期较短，在胚胎发育过程中具有广泛的高水平表达，正常人血中亦有低水平表达^[10]。其生物学特性包括^[11-13]:①促进内皮细胞的增殖；②增加血管的通透性，主要作用于毛细血管后微静脉和小静脉；③改变细胞外基质，为血管生成提供有利的条件；④血管的生成和维持其功能，维持原有血管密度及转运营养物质所必须通透性的作用。VEGF是一类多功能的生长因子，由多种细胞分泌，通过酪氨酸激酶受体发挥作用。有研究表明，肿瘤血管生成的启动是由肿瘤细胞产生的促内皮细胞增殖和迁移的血管生成因子所诱发的，其中VEGF最为重要，实验表明它们在血管形成过程中发挥核心作用，具有非常强大的促进内皮细胞有丝分裂的能力，也是目前发现的最强烈的增加血管通透性的物质之一。近年来国内外学者就肿瘤血管形成过程中VEGF是否起作用、如何起作用以及与肿瘤血管形成的关系如何，分别在各自领域进行了大量研究。体内和体外实验研究已证实，血管形成的增加继发于血管形成因子表达的增加，从而增加原发肿瘤的生长和转移。相反，下调血管生成因子表达，肿瘤新生血管化减少，继而降低肿瘤在原发灶和转移灶的生长。由此可推知VEGF表达在肿瘤血管形成中是一种重要的调节因子。目前认为VEGF至少通过两种机制诱导血管形成:①作为一种内皮细胞有丝分裂原^[12]；②是血管通透性有力的调节因子^[14]。VEGF通过与两种高亲和性的酪氨酸受体(IT-1和KDR)结合而作用于内皮细胞，促进新生血管形成。

在本实验中，肿瘤直径在2.0-2.5cm左右时植入粒子，并在不同的时间切取植入粒子周围的肿瘤组织及正常组织的标本，以观察射频对MVD和VEGF的影响。本实验的结果表明¹²⁵I粒子植入后造成组织少量的炎性细胞浸润等病理表现外，其肿瘤边缘MVD和VEGF的表达较术前均明显降低(P<0.01)，说明¹²⁵I粒子植入治疗后VEGF阳性细胞率及MVD明显降低。¹²⁵I粒子植入治疗可以通过有效地破坏肿瘤微血管，控制肿瘤的血管形成，减少肿瘤的血液供应，有效的灭活肿瘤，减少肿瘤转移机会。证明了¹²⁵I粒子植入治疗可以有效地破坏肿瘤组织地微血管，有效的抑制血管形成并减少肿瘤组织的血液供应，是¹²⁵I粒子植入治疗治疗肿瘤的一项机制。

参考文献

[1] Johnson RC.Hepatocellular carcinoma[J].Hepatogastroenterology,1997，44:307-312.

[2] Huguet C,Addario-Chieco P,Gavelli A,et al.Technique of hepatic vascular exclusion for extensive liver resection[J].American Journal of Surgery，1992，163:602-605.

[3] Mugitani T, Taniguchi H, Takasa A, et al. TNP-470 inhibits collateralization to complement the anti-tumor effect of hepatic artery ligation[J] Br. J Cancer,1998. 77(4):638-642.

[4] Weidner N. Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer[J]. Am J Pathol, 1995, 147(1):9-19. 

[5] Blasko JC,Wallner K,Grimm PD,et al.Prostate specific antigen based disease control following ultrasound guided ¹²⁵I implantation T1/T2prostate carcinoma[J].J Urol,1995，154:1096-1099.

[6] Zhi-Ping Yan, Gui Lin, Hui-Yang Zhao, et al.An experimental study and clinical pilot trials on Yttrium-90 glss microsphere through the hepatic artery for treatment of primary liver cancer.Cancer,1993,73(11):3210~3215

[7] 熊正文，徐昌富，李宏伟，等。非小细胞肺癌中血管内皮标记物显示微血管密度的对比研究。中华胸心血管外科杂志，2003，8(19)：223-225.

[8] Aronsson DE, Muhr C. Quantification of sensitivity of endothelial cell markers for the astrocytoma and oligodendroglioma tumours. Anticancer research, 2002, 22(IA): 343-346.

[9] FerraraN，Henzel WJ，Pitutitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 1989, 161(2):851-858.

[10] Van Der Zee R, Muorhara T, Luo Z，et al.Vaseula endothelial growth factor/vascular permeability factor augments nitric oxide release from quiescent rabbit and human vascular endothelium. Cireulation, 1997，95(4):1030-1037.

[11] Takan S, Yoshii Y, Kondo S, etal. Concecentration of vascular endothelial growth factor in the serum and tumor tissue of brain tumor patients.Cnacer Res，1996，56(9):2185-2190.

[12] Boyle EM Jr，Pohlman TH，Conejo CJ，et al. Endothelial cell injury in cardiovascular surgey: ischemia-reperfusion. AnnThorac Surg，1996，62(6):1868~1875.

[13] Maeda K，ChungYS，Ogawa Y，et al. Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma. Cancer，1996，77(5):858-863.

[14] Dvorakb HF, Brown LF, Detmar M，et al.Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor，microvascular hyper permreabiliy and angiogenesis.Am J Pathol, 1995, 146:1029-1039.

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